Dr hab. Joanna Nizioł, prof. PRz z Katedry Polimerów i Biopolimerów na Wydziale Chemicznym Politechniki Rzeszowskiej im. Ignacego Łukasiewicza uzyskała grant z Narodowego Centrum Nauki w ramach 12. edycji konkursu SONATA BIS. Budżet projektu wynosi 1,9 mln zł. Do konkursu zgłoszono 400 wniosków, a dofinansowanie otrzymało 58 projektów.

Celem projektu pt. „System do obrazowania spektrometrią mas w trzech wymiarach (3D MSI)” jest skonstruowanie pierwszego systemu do trójwymiarowego obrazowania za pomocą spektrometrii mas (MSI), odpowiedniego również do jakościowej i ilościowej analizy próbek biologicznych pod ciśnieniem atmosferycznym.

Technika MSI

MSI to technika obrazowania molekularnego, która umożliwia wizualizację rozkładu powierzchniowego lub przestrzennego cząsteczek. MSI pozwala zlokalizować setki związków chemicznych zarówno endogennych (np. lipidy, peptydy, białka), jak i egzogennych (np. leki, zanieczyszczenia środowiska) na powierzchni obiektu w jednym eksperymencie. Jest to podstawowe narzędzie do analizy powierzchni obiektów pochodzenia naturalnego i syntetycznego. Metody MSI aktualnie stosowane pozwalają lokalizować pierwiastki w metalach, polimerach i półprzewodnikach oraz związki chemiczne w próbkach biologicznych. W biochemii i medycynie tę metodę stosuje się od wielu lat, np. w badaniach lokalizacji metabolitów wydzielanych przez mikroorganizmy, metabolitów tkankowych, farmakokinetyki leków czy do poszukiwania biomarkerów chorobowych.

Obecnie MSI jest najlepszym wyborem w analizie strukturalno-molekularnej próbek biologicznych. Tradycyjne metody obrazowania, takie jak znakowanie lub barwienie immunohistochemiczne w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, pozwalają wprawdzie na wizualizację struktur tkankowych z wysoką specyficznością i rozdzielczością przestrzenną, ale są ograniczone do stosunkowo małej grupy związków. Inne metody, które pozwalają zidentyfikować związki chemiczne, jak np. chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS), wymagają ekstrakcji interesujących analitów z homogenatów tkankowych, przez co traci się ważne informacje dotyczące ich przestrzennego położenia w tkance.

MSI dostarcza informacji nie tylko na temat stężenia czy ilości związków, ale także umożliwia ich lokalizację na powierzchni zróżnicowanych stałych próbek. W typowym eksperymencie MSI wybrany obiekt jest zamrażany, a następnie za pomocą kriotomu przygotowywane są skrawki o grubości (przykładowo) 10 um, które przenosi się na płytkę kompatybilną z instrumentem MS, zazwyczaj o temperaturze pokojowej. Płytka z próbką umieszczana jest w spekrometrze mas, gdzie wykonywana jest seria pomiarów w różnych punktach na badanej powierzchni. Oprogramowanie tworzy obraz z zestawu danych, w którym każdy piksel reprezentowany jest przez widmo masowe. Obraz można wygenerować dla dowolnie wybranej wartości m/z z puli wykrytych przez spektrometr jonów z abundancją, mającą swoje odzwierciedlenie w wyświetlanym kolorze.

Pomiary MSI wykonuje się obecnie wyłącznie w dwóch wymiarach (badanie powierzchniowe, 2D), jednak takie informacje nie są reprezentatywne dla całej objętości badanej próbki, zwłaszcza w przypadku próbek heterogenicznych. Uzyskanie informacji z całej objętości próbki może być kluczowe, zwłaszcza w analizie różnego rodzaju próbek biologicznych.

Mapowanie składu molekularnego w trzech wymiarach jest niezwykle trudne do wykonania, głównie z przyczyn technicznych. Uzyskanie trójwymiarowych reprezentacji rozkładu związku chemicznego jest realizowane zwykle za pomocą komputerowej rekonstrukcji serii danych 2D MSI z wielu niezależnie wykonywanych eksperymentów dla wielu skrawków obiektu. Tego typu podejście realizuje się najczęściej w metodzie laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą (MALDI). Istotną wadą MALDI jest jej małą przydatność w analizie związków o małych masach cząsteczkowych (< 1500 Da), brak możliwości schładzania/zamrażania próbek oraz ograniczanie do płaskich i bardzo cienkich obiektów. W pomiarach stosuje się instrumenty komercyjne, gdzie próbka znajduje się w warunkach wysokiej próżni, czego skutkiem jest wysychanie, zwijanie, pękanie skrawków, ponadto utrata lotnych metabolitów, a obiekty żywe (np. powierzchnia skóry ludzkiej) nie mogą być badane.

Cel projektu

Celem projektu jest skonstruowanie pierwszego systemu do trójwymiarowego obrazowania za pomocą spektrometrii mas .Planowany system 3D MSI będzie miał dwa źródła jonów. Układ optyczny będzie się składał z lasera impulsowego emitującego dalszą podczerwień oraz nowatorskiego toru optycznnego. Proponowana konfiguracja będzie w stanie precyzyjnie kontrolować proces ablacji (usuwania) wybranych warstw obiektu, co ma kluczowe znaczenie dla analizy 3D. W proponowanym systemie 3D MSI próbki będą mogły być analizowane bez konieczności wstępnego ich przygotowania, w stanie natywnym lub zamrożonym oraz pod ciśnieniem atmosferycznym.

Brak konieczności stosowania wysokiej próżni pozwoli zminimalizować problem związany z degradacją próbki oraz niekontrolowanymi jej zmianami podczas eksperymentu. Zastosowane rozwiązania techniczne umożliwią analizę próbek o dużych jak na MSI rozmiarach (nawet 50 x 50 x 20 mm), o niejednorodnej powierzchni. Dzięki sprzężeniu tego systemu z ultrawysokorozdzielczym spektrometrem mas będzie możliwa szybka analiza składu molekularnego. Obiekty testowe, które będą analizowane w ramach realizacji grantu, to tkanki roślinne, zwierzęce, a także tkanki ludzkich nowotworów nerki i pęcherza moczowego. Wyniki zostaną porównane z wynikami uzyskanymi innymi metodami, takimi jak MALDI oraz metodami opartymi na nanocząstkach metali.

Szczegółowy opis badań będzie zamieszczany na stronach zespołu PolyTechnicLab: https://www.facebook.com/profile.php?id=100090123766291 oraz https://twitter.com/PolyTechnicLab

(ip)